Purificação das partículas virais
É necessário dispor de vírus purificados para efetuar certos tipos de
estudo sobre as propriedades e a biologia molecular do agente. Para estudos
de purificação, o material inicial consiste, em geral, em grandes volumes de
meio de cultura de tecido, líquidos orgânicos ou células infectadas. Com
frequência, a primeira etapa envolve a
concentração das partículas virais por precipitação com sulfato de
amônio, etanol ou polietilenoglicol, ou por ultrafiltração. A hemaglutinação
e a elução podem ser utilizadas para concentrar os ortomixovírus.
Uma vez concentrados, os vírus podem ser então separados dos materiais do
hospedeiro por meio de centrifugação diferencial, centrifugação com
gradiente de densidade, cromatografia em coluna e eletroforese.
Em geral, é necessária mais de uma etapa para se obter uma purificação
adequada. A purificação preliminar remove a maior parte do material não
viral. Essa primeira etapa pode incluir centrifugação; a etapa final de
purificação quase sempre envolve centrifugação com gradiente de densidade.
Na centrifugação zonal, coloca-se uma amostra de vírus concentrado em um
gradiente de densidade linear pré-formado de sacarose ou glicerol, e durante
a centrifugação, o vírus sedimenta-se em forma de banda, a uma velocidade
determinada principalmente pelo tamanho e pelo peso da partícula
viral.
Os vírus também podem ser purificados por centrifugação em alta velocidade,
em gradientes de densidade de cloreto de césio, tartarato de potássio,
citrato de potássio ou sacarose. O material de escolha para o gradiente deve
ser o menos tóxico para o vírus. As partículas virais migram para uma
posição de equilíbrio, em que a densidade da solução é igual à sua densidade
de flutuação, formando uma banda visível.
Outros métodos de purificação baseiam-se nas propriedades químicas da
superfície do vírus. Na
cromatografia em coluna, o vírus liga-se a uma substância, como o dietilaminoetil ou a
fosfocelulose, e, em seguida, sofre elução por alterações no pH e na
concentração de sal. A eletroforese zonal permite a separação das partículas
virais de contaminantes com base na carga elétrica. Além disso, podem-se
utilizar antissoros específicos para remover partículas virais do material
do hospedeiro.
É mais fácil purificar os vírus icosaédricos do que os vírus com envelope.
Como os últimos em geral contêm quantidades variáveis de envelope por
partícula, a população viral é heterogênea tanto no seu tamanho quanto na
sua densidade.
É muito difícil obter a purificação completa dos vírus. Pequenas
quantidades de material celular tendem a sofrer adsorção às partículas com a
consequente copurificação. Os critérios mínimos de pureza consistem no
aspecto homogêneo em micrografias eletrônicas e na impossibilidade de outros
métodos de purificação de remover "contaminantes" sem reduzir a
infecciosidade.
Identificação de uma partícula como vírus
Uma vez obtida uma partícula física típica, ela deve preencher os seguintes
critérios para que seja identificada como partícula viral:
1. A partícula só pode ser obtida de células ou tecidos infectados.
2. As partículas obtidas de várias fontes são idênticas independentemente
da origem celular em que o vírus está crescendo.
3. As partículas contêm ácido nucleico (DNA ou RNA), e a sequência não é a
mesma das espécies das células do hospedeiro de onde as partículas foram
obtidas.
4. O grau de atividade infecciosa da preparação varia diretamente com o
número de partículas presentes.
5. A destruição da partícula física por meios químicos ou físicos está
associada a perda da atividade viral.
6. É necessário demonstrar que certas propriedades das partículas e da
infecciosidade são idênticas, como, por exemplo, o seu comportamento de
sedimentação na ultracentrífuga e suas curvas de estabilidade em pH.
7. Os antissoros preparados contra o vírus infeccioso devem reagir com a
partícula característica e vice-versa. A observação direta de um vírus
desconhecido deve ser efetuada por exame ao microscópio eletrônico da
formação de agregado em uma mistura de antissoros e suspensão viral não
purificada.
8. As partículas devem ser capazes de induzir a doença característica in
vivo (se tal experimento for possível).
9. A passagem das partículas em cultura de tecido deve resultar na produção
de uma progênie com propriedades biológicas e antigênicas do vírus.
REFERÊNCIAS
1 BROOKS, G.F. et al. Microbiologia médica. 26.ed. Porto Alegre: AMGH, 2014.
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